野菜の保存技術研究～オゾンを利用した野菜の保存条件検討
収穫した野菜を消費者に届けるまで、できるだけ長期間新鮮な状態に保ったまま保存することが、食料の安定供給や食品の安全につながる非常に重要なことです。
野菜の品質低下（鮮度低下）の最も大きな要因は、付着微生物による腐敗にあります。
収穫した野菜を消費者に届けるまで、できるだけ長期間新鮮な状態に保ったまま保存することが、食料の安定供給や食品の安全につながる非常に重要なことです。
野菜の品質低下（鮮度低下）の最も大きな要因は、付着微生物による腐敗にあります。
このため、色々な殺菌剤が開発されてきました。
しかし、それら薬剤は、健康への影響という大きな問題をはらんでおり、できる限り使用を控えることが求められます。
このため、より安心・安全に野菜を保存するための新しい方法が模索されてきています。
そのような中で、強力な殺菌効果を持ちながら残存性のないオゾンへの注目が集まっています。
オゾンには気体のオゾンガスとオゾンガスを水に溶け込ませたオゾン水がありますが、いずれの効果も同じであり、対象や使用条件に応じて選ぶことが可能です。
本研究では、野菜の保存に対するオゾン効果を確認するために、市販の野菜を使って、付着細菌数を指標として実験を行いました。
殺菌処理効率の比較には、水道水洗浄、オゾン水洗浄、水道水洗浄―オゾンガス暴露、オゾン水洗浄―オゾンガス暴露の4通りの実験系を用意しました。
なお、本記事では、関連する以下の3種類の論文で報告されている2種類の実験について詳細を明らかにします。
論文1：Naitou H.&Tani,Y.,Verification of the efficacy of ozonated water in preventing food poisoning from cucumbers, 環境オゾン研究, 22-4, 2015.
論文2：内藤博敬；野菜の保存技術研究～オゾンを利用した野菜の保存条件検討：調査・報告・学術調査（野菜情報2018年9月号）、alic（独法、農畜産業振興機構）.
論文3：内藤博敬、戸敷浩介；平成29年度野菜関係学術研究委託調査報告書（詳細版） 国産野菜の貯蔵、保存、陳列を目的としたオゾンの利用条件検討.
1.材料および方法
サンプル洗浄
実験１
市販のキュウリ10個を各試験に用いました。
サンプルの洗浄は、大量調理施設衛生管理マニュアル5）に従い、衛生害虫、異物混入、 腐敗・異臭等とチェック後に水洗しました。洗浄は水道水またはオゾン水で行い、オゾン水濃度は、0.5,1,2,4mg/Lとし、タッパー内で3回繰り返しています。
オゾン水はOPENICS-220(Nikka Micron)を使って4mg/Lの濃度になるようにして作成し、作成後ただちに超純水にて所定の濃度まで希釈しました。
オゾン水中のオゾン濃度はPack Test（共立化学―チェックLab）でキュウリの処理直前に確認しました。
実験2
ゴーヤ、ミニトマト、ニンジン、ピーマン、ナス、キュウリを論文1と同様に点検後、水洗しました。
タッパー内で、野菜の種類ごとに100ml～500mlの水道水あるいはオゾン水（4mg/L濃度）で、3回ずつ水洗。オゾン水生成装置とオゾン濃度測定には同上の装置を用いています。
恒温器内でのオゾンガス曝露には、多重リング式コロナ放電オゾンガス発生装置（maxcell社、MXAP-AR200WH）を用いて、恒温槽内のオゾン濃度を0.05ppmになるように調節して行いました。
細菌の分離と同定（実験1、2共通）
サンプルをSCDデンプンプレート上にストリークし、培養後に細菌をコロニーから抽出、再培養。
再培養液には液体SCDデンプン培地を用い、37℃で24時間振とう培養しました。
その後、18,700rpmで遠心し、沈殿から細菌を集め、上清中のゲノムＤＮＡはQIAamp DNA mini kit (QIAGEN)で抽出しました。
抽出したDNAのうちの20～30ngをPCR増幅用のテンプレートに用いてサーマル サイクラー（GeneAmp PCR system 9600）で PCR 増幅を行いました。
プラーマーには、Shinodaら（2000）により設計された16SrRNA遺伝子増幅用の塩基配列を持つ、519ｆ／1492ｒプライマーペアを使用。
PCR増幅産物を精製後、対象DNAのバンドを電気泳動にて確認し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（Takara）で精製。
精製DNAの塩基配列をDNAシーケンサーで解析し、得られた配列をDNA 解析ソフト DNAsis（日立）にて解読しました。
DNAシーケンスデータはNCBIデータベース上でBLAST検索して、細菌種を同定しました。
市販のキュウリに関するオゾン水洗浄効果の検証（実験1）
水洗またはオゾン水洗浄したキュウリをジプロック中100mlの浅漬液に浸し、浅漬液を浸透させました。その後、液100μlをデンプンゲル上に展開して、一晩37℃で静置培養してコントロールサンプルとしました。
一方、浅漬液の染み込んだキュウリはバイオチャンバー中で、夏季条件と同じ30℃に保って保存しながら、2時間ごとに5mlずつを採取。このうちの3mlを分光光度計で600nmにて濁度測定したを行いました。
同様に、ATPテストサンプルも2時間おきに採取して測定しています。
水分含有量、ポリフェノール濃度測定法（実験2）
「栄養表示基準における栄養成分等の分析方法等について(平成11年4月26日 衛新第13号)」に従い、野菜サンプルの約5gの切片を5片作り、70℃で5時間保存した後に、これらの切片中の水分含量を計測しました。
ポリフェノール含有量測定にはポリフェノールパックテスト（共立理化）を用い、ビタミンＣ含有量を差し引いて算出。測定用サンプルは、圧縮プロセッサーにて野菜を絞って、得られた抽出液としています。
オゾン水洗浄およびオゾンガス曝露による保存試験（実験2）
洗浄後のサンプルをステンレス保存庫内で室温（20℃±5℃）保存し、その後、試験に供しました。
試験用サンプル5gを切断し、10mlの液体培地に浸した、そこから100μｌを採取して寒天培地に展開し、37℃、24時間静置培養して、生菌数を確認しました。
2.結果と討論
大腸菌の塩耐性テスト（実験１）
大部分の浅漬は0.5～2％の塩分濃度の範囲になるように作られています。これは、哺乳動物の体内塩分濃度である0.9%に近いため、細菌の増殖には最適な塩分濃度と考えられるからです。
筆者らは、この点を確かめるために、大腸菌の塩分濃度に対する耐性チェックを行いました。
0％から10％までの塩分濃度での大腸菌培養を行って、どの程度の塩分濃度まで生存可能かを調べました。その結果、5％までは増殖するものの、10％の濃度になると増殖できないことが判明。
この結果を踏まえて、本研究で用いる浅漬の塩分濃度は1％とすることとしました。
野菜から分離・同定された細菌の遺伝子同定
（1）キュウリから分離・同定された細菌（実験１）
キュウリから8種類の細菌が同定されました。
それらは、Enterobacter cloacae（水や土壌中に多い感染症の原因菌）, Escherichia hermannii（大腸菌の仲間）、Kosaconia cowanii、Staphylococcus aureus（ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌のような病原性を持つ種類もある））、Salmonella bongori、S. sciuri（これら2種はサルモネラ菌の一種）、Acinetobacter calcoaceticus、A.oleivorans（院内肺炎原因菌）です。
これらのうち、最初の4種は人由来の細菌と思われ、また、最初の3種は、受精か栽培過程でキュウリに感染したものと推定されました。
残りの4種は人から分離されたことが無く、環境由来のものと考えらます。特に多くの食品汚染源になるケースが多いSalmonera bongoriは、爬虫類の定住菌です。
環境由来細菌の汚染源は不明ですが、販売陳列中、高温での貯蔵中、浅漬のような高栄養状態下での汚染が考えられます。
野菜から分離・同定された細菌の遺伝子同定
（2）ゴーヤ、ニンジン、ミニトマト、ナスから分離・同定された細菌（実験2）
ゴーヤでは、水道水洗浄とオゾン水洗浄とで含有細菌種に違いが認められました。前者ではPseudomonas 属が、後者では Bacillus subtilis、Acidovorax、Pantoea 属が優先種でした。
Pseudomonas 属は土壌環境由来、その他の菌は不明な環境由来と推定されます。
ミニトマトでは、洗浄前にも優先的に見られたPantoeaが、水道水洗浄後でもオゾン水洗浄後でも細菌種の多くを占めていました。
そのほかには、洗浄前には見られなかったPseudomonasuとStaphylococcus属の細菌が水道水洗浄後には出現していました。
ニンジンの洗浄前サンプルからは、他の野菜からは検出されていないKlebsiella、Raoultella、Atenotrophomonas属が発見されましたが、洗浄後にはこれらの菌種が消滅し、代わりにPseudomonas, Bacillus, Pantoea属が優先種になります。
洗浄前サンプルに存在した細菌類は、ニンジンサンプルに付着していた土壌汚染のせいであると考えられます。
ピーマンでは、洗浄前には細菌が認められず、水道水洗浄サンプルからStaphylococcus xylosus、S.succunusが、オゾン水洗浄後のサンプルからはBacillus、Pantoea、Rhizobium属の細菌が見つかっています。他の野菜からは検出されていないStaphylococcus xylosusは、ピーマンの袋ズメ作業中に人から感染したものと推定されました。
ナスの洗浄後の細菌ではPantoeaが優占種であり、人由来菌と思われるP.aeruginosa,S.xylosusも見つかっています。後者の細菌は、ナスの流通過程で人から感染したものと推定されました。
オゾン水での洗浄効果（実験1）
オゾン水でのキュウリの洗浄による細菌除去効果は、オゾン水と水道水で洗浄したサンプル中の細菌増殖状態を、サンプル中の細菌の培養液の濁度で比較して判断しています。細菌の培養は30℃で行い、2時間ごとに濁度検定用のサンプルを採取。濁りが強い方が、細菌がより増殖していることを示します。
その結果、いずれのサンプルでも、時間の経過とともに濁度の増加が判明しました。オゾン濃度が0.5ml/Lと1mg/Lのオゾン水で処理したサンプルでは、水道水で処理したサンプルと比べてやや濁度が低下した程度で大きな違いはありませんでした。
一方、オゾン濃度が2ml/Lと4mg/Lのオゾン水で処理したサンプルでは、水道水で処理したサンプルと比べて濁度の顕著な低下が認められ、細菌の増殖が抑えられていることが判明。これは、培地上に形成されたコロニー数を見ても一目瞭然で、コントロールでは、プレート一面が細菌のコロニーで埋め尽くされるのに対して、4mg/Lのオゾン水で処理したサンプルでは1プレート上に数十個のコロニーが認められるに過ぎませんでした。
一方、細菌量を推定するためのATP活性の測定も行われています。ATP活性は生物が生存していることを示す指標であり、数値が高いほどより多くの細菌が生息していることを意味します。実験の結果は、濁度の測定結果と同様で、いずれのサンプルでも、時間の経過とともに濁度が増し、オゾン濃度に比例して濁度が減少する傾向が認められました。
この2種類の測定によって、高濃度のオゾン水が細菌の増殖抑制に効果的であることが明らかになりました。
オゾン水での洗浄効果（実験2）
ゴーヤ、ミニトマト、ニンジン、ピーマン、ナスに付着していた細菌に対しては、洗浄による除去効果が認められました。
生ゴーヤで10^4オーダーあった細菌数が、水道水やオゾン水洗浄後には10^3オーダーに減少。
生ミニトマトの生菌数は10^3オーダーで、洗浄後も若干減少した程度でした。
生ニンジンの生菌数は10^3オーダーと大きかったものの、水道水洗浄で10^3弱に、オゾン洗浄で10^3オーダーにまで減少。
ピーマンの生菌数は10^2オーダーで、洗浄後も目立った減少は認められませんでした。同様に、10^6近くあったナスの生菌数も、洗浄後も余り大きくは減少しませんでした。
このように、洗浄効果は野菜の種類によって異なり、ゴーヤとニンジンでの効果が大きく、反対にミニトマト、ピーマン、ナスでは除去度合いは少ないものでした。
細菌の除去率はオゾン水洗浄の方が大きく、ゴーヤでは洗浄前と比べて10倍以上、ニンジンでは100倍以上にもなり、とくにニンジンでは水道水洗浄と比べても50倍で除去率が向上していました。
水道水またはオゾン水で洗浄後のオゾンガス暴露の有無という4通りの異なる実験条件ごとの殺菌作用（実験2）
①水道水-オゾンガス非暴露、②オゾン水-オゾンガス非暴露、③水道水-オゾンガス暴露、②オゾン水-オゾンガス暴露
洗浄後のゴーヤの生菌数は10^4から10^3オーダーまで減少したものの、保存期間中に①、②、③の3条件では、細菌数が108/gオーダー程度まで急増しました。④の場合のみ10^4程度と保存前と比べて10^1程度のわずかな増加にとどまっていました。
ミニトマトでは、保存前の10^4オーダーから①の条件で10^8オーダー近くまで急増。しかし、②、③では10^4オーダーで保存前よりやや増加した者の静菌効果が認められ、さらに、④では10^3と保存前よりも減少していて、殺菌効果も認められました。
ニンジンでは、洗浄効果が大きかったものの、その後の貯蔵期間中に、オゾンに暴露しない場合には10^7～10^8オーダー近くまで菌量が増加。ただし、③と④オゾン暴露しながらの貯蔵の場合には10^4強と静菌作用が認められています。
洗浄前後で菌数が10^2オーダーと少なかったピーマンは、オゾンに暴露しないで保存した場合には10^4オーダーまで菌数が増加。
水道水洗浄後にオゾン暴露しながら保存すると10^3個程度の細菌数で、オゾン水洗浄後にオゾン暴露しながら保存すると細菌の生育が認められませんでした。
これは、この条件下での殺菌作用の強さを表すのか、あるいはもともとの細菌数が非常に少なかったための誤差の範囲のものか断定できません。
洗浄前後で10^5～10^6とあまり変化がなかったナスでは、オゾン暴露なしで保存した場合には菌数が107オーダーまで菌数が増加したものの、水道水で洗浄後にオゾンガス暴露して保存した場合には104オーダーと殺菌効果が認められました。
ナスでもピーマンと同様に、オゾン水洗浄後にオゾン暴露しながら保存すると細菌の生育が認められませんでした。
ナスの場合には処理前の付着生菌数が非常に多いため、この結果は、オゾン水洗浄とオゾンガス暴露の相乗効果が極めて有効に働いたと考えられます。
サンプル中の水分含有量と洗浄方法（実験2）
水道水またはオゾン水で洗浄後7日間オゾン曝露したニンジンで、元の含水量と比べて10％近くが減少したものの、それ以外の野菜での水分量消失は数％程度であり、オゾン暴露野菜とオゾン非暴露野菜との間での水分消失量に顕著な違いは認められませんでした。
オゾン暴露ニンジンでの大きな水分消失は、オゾン曝露した場合に生じた空気の対流のせいとも考えられます。
比較のために行った葉物野菜のレタスの場合、水分含有量が急激に低下して品質低下が著しく、検討対象にはなりませんでした。
また、ジャガイモでは、洗浄後には、やはり急激な水分消失が起こり、こちらも検討対象サンプルとしては不適切でした。
サンプル中のポリフェノール含有量と洗浄方法（実験2）
サンプル中のポリフェノール含有量およびビタミンＣ含有量の分析では、保存前と後とで含有量に違いは認められませんでした。
サンプル中のエチレン含有量と洗浄方法（実験3）
保存中のサンプル中のエチレンガスの検出を行いましたが、検出されませんでした。オゾンガスによってエチレンが酸化されて検出限界を下回った可能性があります。
サンプルの視覚的変化と洗浄・保存方法（実験2）
ミニトマトとナスのサンプルでは、オゾン水洗浄―オゾン非暴露あるいはオゾン水洗浄―オゾン暴露サンプルで、水道水洗浄―オゾン暴露や水道水洗浄―オゾン非暴露サンプルよりも光沢が強いことが判明しました。
このことは、オゾン水処理が効果的であることを示します。これは、野菜表面に付着する有機物（微生物を含む）がオゾン水処理で除去されたためと推察されます。
ニンジンでは、水道水洗浄後にオゾン非暴露状態で保存したサンプルの一部分が黒変して腐敗が生じていました。
事実、このサンプルでは、細菌数が107個/gオーダーに増加。一方、オゾン処理（オゾン水処理かオゾン暴露、あるいは両方の処理）を加えたサンプルでは腐敗現象は認められていません。
この結果は、オゾン処理が細菌増殖抑制に効果的であったことを示すものです。
密閉保存条件下で行った本実験系では、オゾン処理で野菜の腐敗を進める細菌の増殖を止められることを明らかにできましたが、野菜のエチレン放出量については、オゾンによるエチレンガス酸化のせいで計測できなかった可能性が指摘されています。
このため、今後は、開放系の容器を用いた試験を行う必要があります。
その場合には、実際の販売空間あるいは冷蔵ショーケースなどの中でオゾンガス曝露する方法が試みられるべきです。
一方、密閉容器内でのオゾン処理に関して、オゾン水の噴霧や、オゾン水循環槽の中での保存についても、今後検討していきたいとしています。
3.まとめ〜オゾンの優位性
一般的に、野菜類に付着している細菌数は10^46(10^2～10^9)/gに上るとされ、きちんとした洗浄作業が必須です。
大量調理施設衛生管理マニュアル（厚生労働省,2018）には、次亜塩素酸などの界面活性剤などの使用が含まれていますが、食品の安全性の観点からは、この種の化学物質の使用は推奨されるものではありません。
なぜなら、次亜塩素酸は台所で使う酢（酢酸）などと反応して有害な塩素を発生する上、強力な漂白作用があるため食品の入りを退色させてしまいます。
これに対してオゾンにはそのような作用はありません。
この研究の結果、キュウリから食品汚染の源であるサルモネラ菌を含む8種類の細菌が検出されました。
浅漬は、細菌の生育に必要な栄養分に富み、理想的な塩分濃度を持つため、細菌の増殖にとっては理想的な環境を提供すると考えられます。
そこで、材料となる野菜の事前の十分な洗浄が必要であり、そのためにオゾン水は有効です。
オゾン生成器で発生させたオゾンは、直ちにほかの物質と反応して強い酸化反応を引き起こします。
反応の強さは、オゾン濃度とオゾンへの暴露時間の積で表されるため、より濃い濃度でより長時間暴露すれば、高い殺菌効果が得られます。この効果は、オゾンガスを水中に溶け込ませて作るオゾン水でも同様です。
この実験では、オゾン水に対象サンプルを浸漬処理しましたが、流水中にオゾンガスを溶け込ませた状態でサンプルと反応させることができれば、より低濃度のオゾンで高い効果を得ることができるはずです。
本研究では、4mg/Lのオゾン水100mL（最低量）に1分間浸漬し、3回洗浄。ここから、オゾンの酸化力を計算すると、4×0.1×1×3＝1.2mg・min/Lとなり、一般的に用いられているオゾン水製造装置で作られるオゾン水の濃度（0.6～1mg/L）ほぼ同等になります。
この操作を流水で行うとすると、野菜業者が行っているのと同程度の2/分の水流で1分間の洗浄で十分です。
洗浄時間を10倍にすればオゾン濃度を1/10にしても同等の効果が得られるので、人体に極めて安全な処理系を作ることができます。
一方、本実験で用いたオゾンガス濃度は、作業環境基準を考慮して0.05ppmを上限に設定しています。このような低濃度でも、オゾン処理によって付着細菌数は1週間で有意に減少。
細菌増殖抑制効果は野菜の種類によって強弱はあるものの、全ての野菜で、静菌的あるいは殺菌的な効果が認められました。
また、オゾン水での洗浄効果も認められ、洗浄前の野菜に付着していた細菌を減らす効果のあることが明らかです。
本研究から、オゾン水が細菌増殖抑制に効果的であることが判明しましたが、オゾン水洗浄とオゾンガス曝露の組み合わせによって、最強の静菌あるいは殺菌効果が得られ、微生物汚染を原因とする野菜の腐敗、劣化を低減し、保存期間の延長に貢献することが示されました。
これに対して、オゾン処理のデメリットとして、密閉容器中でのオゾンガス暴露の過程で野菜から水分が蒸発することが挙げられます。
この問題の解決には、オゾンガスに加えてオゾン水を噴霧することや開放系での保存が必要です。
本実験で同定された細菌の中でも最も厄介なものの一つに納豆菌があります。この菌は、生存に適さない環境になると芽胞という殻を作ってその中で冬眠状態になって生きながらえることができます。
芽胞は100℃の加熱でさえ死滅しない場合があるなど、極めて強いため、芽胞を作る菌の除去は大きな課題に。
著者らは、乾燥シイタケに付着する有芽胞菌に対するオゾン曝露の効果確認を追加実験として行っています。その結果、オゾンガス曝露3日目～5日目にかけて菌数が減少し、その後7日目まで菌数が維持されることが明らかにされました。
オゾン濃度が低いため完全な殺菌にまでは至らなかったものの、芽胞に対するオゾン効果を示す実証実験となりました。
このようにオゾン効果は、一般的な非芽胞細菌だけでなく、芽胞にも威力を発揮することが明らかです。
このため、新鮮野菜や加工野菜に対して、オゾン水やオゾンガス、あるいはこの両方に暴露することで、野菜の品質を維持したまま、流通はもちろん、保存、貯蔵、陳列期間を延長できる可能性があります。
今後はオゾン水中でのオゾン濃度を維持する方法や、オゾン水流水中での洗浄によりオゾンと細菌の接触効率を上げる研究などが必要となります。
とくに、オーバーフロー方式での洗浄処理は大きな効果を生むことが分かっているため、著者らは、今後は、オゾン水をかけ流し方式で行える実験系を考案し、さらに高いオゾン水効果を実証したいとしています。
また、オゾン水の使用に関するマニュアルと、オゾン水を生成する機器の性能評価に関するガイドラインを確立する必要があるとも提言しています。
[参考論文]
Naitou H & Tani,Y,Verification of the efficacy of ozonated water in preventing food poisoning from cucumbers,環境オゾン研究,22-4,2015.
https://www.researchgate.net/publication/291774954_Verification_of_the_efficacy_of_ozonated_water_in_preventing_food_poisoning_from_cucumbers
内藤博敬, 野菜の保存技術研究～オゾンを利用した野菜の保存条件検討：調査・報告・学術調査（野菜情報2018年9月号）、alic（独法、農畜産業振興機構）
https://vegetable.alic.go.jp/yasaijoho/senmon/1809/chosa01.html
内藤博敬、戸敷浩介,平成29年度野菜関係学術研究委託調査報告書（詳細版） 国産野菜の貯蔵、保存、陳列を目的としたオゾンの利用条件検討
https://www.alic.go.jp/content/000153659.pdf
篠田吉史、加藤暢夫、森田直樹,16SrRNA遺伝子解析による細菌の系統分類法、島津評論,57:121-131,2000
https://www.shimadzu.co.jp/products/tec_news/srv57_12/report15.html
栄養表示基準における栄養成分等の分析方法等について, （別添）栄養成分等の分析方法等、消費者庁
https://www.caa.go.jp/policies/policy/food_labeling/food_labeling_act/pdf/foods_index_18_180119_0003.pdf
大量調理衛生管理マニュアル改正版、厚生労働省,201
https://www.mhlw.go.jp/file/06-Seisakujouhou-11130500-Shokuhinanzenbu/0000168026.pdf